Kromatografi UAS

Bismillahirrohmanirrohim

Jakarta, 20 Juli 2016

KROMATOGRAFI

Dosen Pengampu : Rabima Kurniawan, M.Farm, Apt.

Pertanyaan yang mungkin diujikan

1.       Apa yang dimaksud dengan kromatografi kolom?

2.       Apa saja manfaat dari kromatografi kolom, terutama bidang farmasi? Sebutkan pula kekurangan kromatografi kolom!

3.       Jelaskan jenis dan prinsip dari kromatografi kolom?

4.       Apa yang dimaksud dengan KCKT?

5.       Sebut dan jelaskan fungsi instrumen KCKT?

6.       Apa yang membedakan elusi isokratik dan elusi gradien dari suatu kromatografi kolom?

7.       Apa saja persyaratan fase gerak untuk KCKT?

8.       Jelaskan bagaimana prinsip kerja KCKT?

9.       Apa saja keunggulan dan kelemahan KCKT?

10.   Bagaimana cara memilih fase gerak untuk KCKT?

11.   Bagaimana mengetahui resolusi yang baik dari hasil kromatogram?

12.   Apa yang dimaksud dengan waktu retensi?

13.   Apakah yang dimaksud kapasitas kolom dalam kromatografi kolom?

14.   Apakah yang dimaksud jumlah lempeng teoritis dalam kromatografi kolom

Opsi jawaban untuk kemungkinan soal yang diujikan?

1.    Kromatografi kolom adalah metode pemisahan suatu campuran yang dimasukkan ke dalam kolom dan mengalir perlahan karena adanya gaya gravitasi melewati fase diam. Zat-zat penyusun campuran terpisah berdasarkan kecepatannya mengalir pada fase diam.

2.    Kromatografi kolom dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif serta untuk memisahkan substansi penting dalam analisis farmasi seperti pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan untuk pemurnian substansi. Dengan data-data yang didapatkan, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru atau untuk mengontrol kondisi agar obat bertahan lama. Kromatografi kolom dapat digunakan untuk investigasi fluida badan seperti air liur untuk mengetahui jenis penyakit. Seperti pada perokok berat akan terdapat sianida (-CN) pada sampel liurnya. Deteksi senyawa oksalat dalam air kencing dapat dilakukan dengan kromatografi untuk pasien yang menderita batu ginjal. Hanya saja kromatografi kolom memiliki kelamhan seperti memerlukan persiapan yang lama dan masih diperlukan teknik manual dalam mempersiapkan kolom kromatografi.

3.    Pada dasarnya, ada empat jenis kromatografi yang digolongkan sebagai kromatografi kolom. Kromatografi Adsorpsi merupakan kromatografi cair atau gas pada fase diam padat. Kromatografi Partisi mempunyai fitur mirip pemisahan dengan cara ekstraksi cair-cair. Dalam hal ini, fase diamnya adalah cairan yang didiamkan pada penyangganya. Kromatografi Gel memisahkan berdasarkan ukuran partikelnya serta Kromatografi Pertukaran Ion yang sering kali digunakan dalam proses pemurnian.

4.    KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tnggi) adalah metode kromatografi cair yang menggunakan fase diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan fase geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat ke dalam kolom dengan bantuan pompa atau tekanan.

5.    Instrumen KCKT beserta fungsinya meliputi:

a.       Gradient controller/ Solvent Reservoir (Wadah fase gerak), yaitu alat yang akan menampung fase gerak yang akan dialirkan ke dalam kolom dengan adanya bantuan pompa.

b.      Pump (Pompa), yaitu alat yang akan mendorong fase gerak masuk ke dalam kolom

c.       Sample introduction/injector (alat penginjeksi sampel), yaitu tempat memasukkan cuplikan atau sampel dengan bantuan syringe

d.      Kolom, yaitu tempat terjadinya pemisahan komponen-komponen cuplikan

e.      Detector, yaitu alat untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom

f.        Data output/monitor/komputer, yaitu alat yang akan menampilkan hasil yang telah diperoleh berupa kromatogram.

6.    Elusi Isokratik adalah penggunaan pelarut yang tetap, tidak berubag-ubah selama proses elusi. Sedangkan elusi Gradien/landai adalah penggunaan pelarut yang berubah-ubah selama proses elusi berlangsung.

7.    Fase gerak untuk KCKT haruslah sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan diujikan; fase gerak harus murni dari kotoran yang mengganggu; fase gerak mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, tidak toksik; Fase gerak memiliki viskositas rendah, tidak melebihi 0,5 Centi Poise da harus sesuai dengan detektor

8.    Prinsip kerja KCKT adalah sebagai berikut : sampel yang telah dilarutkan dalam pelarut yang sesuai diinjeksikan melalui bagian injeksi sampel kemudian dengan bantuan tekanan dari pompa, fase gerak akan membawa sampel bergerak melewati kolom kromatografi yang berisi fase diam. Karena adanya interaksi antara fase diam dan fase gerak maka campuran senyawa akan terpisah menurut daya afinitas terhadap kedua fase. Proses pemisahan campuran dapat diamati dengan adanya detektor yang kemudian akan menampilkan hasil pemisahan tersebut dalam bentuk grafik yang terlihat pada layar monitor.

9.     Keuntungan KCKT diantaranya adalah

1.       Kerja lebih mudah dengan adanya otomatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data

2.       Volume sampel kecil

3.       Daya pisah tinggi

4.       Metode analisis yang cepat, tepat, peka, akurat, reproducible dan preparatif

5.       Dapat digunakan untuk sampel organik dan anorganik, bersifat volatil dan non volatif, maupun sampel yang stabil maupun labil secara thermal

6.       Pilihan fase diam dan fase geraknya luas

Kelemahannya adalah

1.    Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus

2.    Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

10.  Untuk menentukan fase gerak pada KCKT maka dilakukan beberapa pendekatan seperti melakukan penelusuran melalui pustaka atau literatur. Bila tidak menemukan maka dilakukan percobaan melalui KLT. Cara ini dilakukan dengan memilih fase diam KLT sejenis dengan fase diam kolom yang akan digunakan. Lakukan eluasi dengan fase gerak yang paling non polar, lakukan kenaikan kepolaran secara gradien. Evaluasi hasil dan tentukan komposisi fase gerak yang paling baik.

11. Hasil resolusi (R) yang baik adalah apabila puncak A (satu) dengan puncak yang lainnya (B) terpisah sempurna dengan nilai R ≥1,5. Jika kurang dari nilai ini maka resolusi akan tumpang tindih.

12.  Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan oleh analit dari awal kolom untuk sampai ke detektor. Semakin lama analit berinteraksi dengan fase diam yang ada pada kolom maka semakin lama ia keluar, semakin besar waktu yang dibutuhkan.

13.  Kapasitas kolom adalah kemampuan kolom dalam menampung analit. Semakin lama analit berada dalam kolom, maka semakin besar nilai kapasitasnya. Kapasitas yang baik antara 1-10. Jika kapasitas terlalu kecil, kemungkinan pemisahannya belum sempurna dan jika terlalu besar maka akan terjadi pelebaran puncak.

14. Jumlah lempeng teoritis adalah parameter menghitung efisiensi kromatografi yang menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibaa oleh fase gerak selama elusi.